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13144   发表于 2018-1-4 19:14:17 |栏目:
PCR常见问题分析与对策
PCR产物的电泳检测时间
  一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性,不出现扩增条带
  PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
  模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
  酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
  引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有 引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条 亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不 够,引物之间形成二聚体等。
  Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
  反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
  物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出 现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。
  靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
  引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。
需重新设计引物。
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hope0815

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hope0815   发表于 2018-1-6 23:01:36 |栏目:
么有分,谁能送我点搬砖数值啊::>_<::

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buslink

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buslink   发表于 2018-1-9 11:11:23 |栏目:
我帶著醬油瓶路過一起下吧的,還是忍不住小手一抖!

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xiaoxia

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xiaoxia   发表于 2018-1-11 09:00:57 |栏目:
这个資源一般般,不過我喜歡

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eclipse_23

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eclipse_23   发表于 2018-1-13 03:50:00 |栏目:
這個資源非常需要,支持一起下吧!

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oly

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oly   发表于 2018-1-16 03:17:42 |栏目:
珍惜生命,果断回帖;酌一杯清茶,品一起下吧资源

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daijianfu

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daijianfu   发表于 2018-1-18 03:35:46 |栏目:
啥也不说了,感谢一起下吧和楼主的分享哇!

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zp0220

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zp0220   发表于 2018-1-19 09:18:26 |栏目:
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wzmyhl

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wzmyhl   发表于 2018-1-21 09:28:02 |栏目:
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ooooook

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ooooook   发表于 2018-1-22 04:20:30 |栏目:
這麼好的帖子都沒有人頂!d=====( ̄▽ ̄*)b,我來多頂頂樓主

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